Принципы работы ППР-сенсоров. Промышленные ППР-сенсоры
23.3. Промышленные ППР сенсоры
В табл. 23.1, взятой из работы [ [ 54 ] ], указаны названия многих интеллектуальных ППР сенсоров, которые промышленно выпускались в начале ХХІ в. Все они рассчитаны на реализацию нескольких методик анализа, нуждаются в небольших объемах пробы, большинство из них частично автоматизированы. Некоторые имеют несколько каналов для одновременного сопоставительного анализа нескольких проб.
| № п/п | Фирма | Название ППР биосенсора | Источник информации |
|---|---|---|---|
| 1 | Biacore AB | BIACORE 1000, 2000, 3000 | Biacore.com |
| 2 | Reichert Analytical Instruments, Inc. | SR7000 | http://www.reichertai.com |
| 3 | Affinity Sensors | Iаsys, Iasys Plus, Iasys Auto+ | Affinity-sensors.com |
| 4 | IBIS Technologies | IBIS I, IBIS II | Ibis-spr.nl |
| 5 | Nippon Laser Electronics | SPR670, SPR Cellia | Nle-lab.cojp/English/ZO-HOME.htm |
| 6 | Texas Instruments | Spreeta | ti.com/sc/docs/products/msp/control/spreeta |
| 7 |
Analytical  -Systems |
BIO-SUPLAR 2 | Micro-systems.de |
| 8 | AVIV Instruments | PWR Model 400 | Avivinst.com |
| 9 | Farfield Sensors Ltd | AnaLight Bio250 | farfield-sensors.co.uk |
| 10 | Luna Innovations | Fіber optic prototype | lunainnovations.com |
| 11 | ThreeFold Sensors | Label-free prototype | ic.net/~tfs |
| 12 | Graffinity | Plasmon Imager | Graffinity.com |
| 13 | Leica | Prototype | Leica-ead.com |
| 14 | Prolinx | OCTAVE | Prolinxinc.com |
| 15 | HTS Biosystems | SPR array | Htsbiosystems.com |
| 16 | Quantech Ltd | FasTraQ SPR array | quantechltd.com |
| 17 | SRU biosystems | BIND | Srubiosystems.com |
Одним из наиболее известных ныне в мире промышленных ППР сенсоров является "BIACORE 3000" шведской фирмы Biacore AB, показанный на рис. 23.7 [ [ 64 ] , [ 83 ] ]. Он состоит из мини-компьютера и сенсорного блока размерами 760x610x350 мм и массой до 50 кг. Рассчитанный на стационарное использование в лабораториях, он является наиболее высокопроизводительной и чувствительной исследовательской системой для изучения взаимодействия биохимических веществ. Чувствительность анализов достигает 1 пМ = 10–12 моля. Допустимый диапазон изменения показателя преломления исследуемой жидкости – от 1,33 до 1,40.
В оптимальных условиях проведения экспериментов BIACORE 3000 позволяет зафиксировать сдвиг резонансного угла от 10 RU до 70000 RU. Специально введенная единица 1 RU (resonance unit – единица резонанса) эквивалентна сдвигу, вызываемому связыванием 1 пикограмма (10–15 кг) протеина на 1 мм2 чувствительной поверхности. Способность регистрировать связывание биомолекул с такой высокой чувствительностью гарантирует надежность получаемых результатов и высокое качество их интерпретации. В системе параллельно работают и одновременно могут быть задействованы 4 проточных канала измерений. Результаты, полученные от канала сравнения, могут автоматически вычитаться из результатов, получаемых в других каналах, что позволяет повысить разрешающую способность и информативность каждого анализа.
Технические усовершенствования управляемой проточной системы обеспечили возможность автоматической загрузки исследуемых образцов, точную автоматическую инъекцию проб, регулирование скорости потока от 1 до 100 мкл/мин., минимальные затраты ценных реактивов. Для проведения эксперимента и регистрации сигналов связывания во всех 4 каналах хватает лишь 1 мкл раствора. Малый объем проточного канала 0,02 мкл свел потери к минимуму. Специальное программное обеспечение позволяет автоматически проводить заданные процессы иммобилизации белков на поверхности металлической пленки, исследовать как отдельные образцы, так и осуществлять серии исследований с автоматической сменой растворов или/и образцов, выполнять детальную обработку результатов, вычислять все нужные пользователю показатели кинетики биохимических реакций. Имеется, например, и программа моделирования взаимодействий, которая позволяет еще до загрузки реальных образцов оптимизировать условия и последовательность проведения экспериментов с ними.
С помощью сенсора Biacore 3000 можно изучать как малые молекулы, начиная от молекулярной массы 180 а.е.м., так и большие клетки, бактерии, антитела, и находить ответы на такие, например, вопросы, как:
- насколько специфическим является связь между молекулами (клетками) двух данных видов?
- с какой скоростью происходит их связывание?
- насколько сильной является их связь?
- при каких условиях можно её разорвать?
- как влияют температура, кислотность, концентрация, вид растворителя или третье вещество (фермент, катализатор, антитело) на ход реакций их связывания?
Поэтому эта система и подобные ей широко используются для исследований функций отдельных белков и других биохимических веществ, молекулярного распознавания, для исследований и анализов в областях иммунологии, онкологии, вирусологии, инфекционных заболеваний, биотехнологии и др. Многочисленные применения такого типа ППР сенсоров описаны в сотнях работ. Сошлемся лишь на одну из них [ [ 328 ] ], где показана эффективность метода ППР для регистрации и изучения ферментативных реакций при участии NADH и NADPH, которые сыграют важную роль в биохимии.
Типичной технологией применения является следующая (см., например, [ [ 54 ] , [ 152 ] ]). На чувствительную поверхность ППР сенсора устанавливают специальную проточную ячейку (flow cell), которая через патрубки присоединяется к системе регулирования потока исследуемой жидкости с использованием перистальтического насоса и инъекционного клапана. Поскольку проточная ячейка и патрубки очень тонкие (для экономии дорогостоящих препаратов), все жидкости должны быть профильтрованы сквозь 0,2 мкм фильтр и тщательно дегазированы. Вся проточная система должна регулярно промываться специальными растворами.
При биохимических исследованиях обычно проводят подготовительный цикл. В этом цикле через проточную ячейку прокачивается сначала раствор протеина, который оседает мономолекулярным слоем на поверхность золотой пленки. Потом прокачивают раствор тех биохимических молекул или антител, взаимодействие которых с молекулами или частицами аналита нужно изучить. Они присоединяются к протеину и образуют биорецепторный слой (лиганд). Эта процедура может длиться 1...2 ч. В цикле измерений проточная ячейка и чувствительная поверхность сначала промываются несколько минут буферным раствором ( рис. 23.8, фаза І). Потом через ячейку прокачивается заданный объем жидкости с исследуемым аналитом, и начинается измерение (фаза ІІ). Частицы аналита присоединяются к лиганду не сразу. Поэтому кривую ППР приходится измерять многократно, каждый раз рассчитывая по результатам измерений точное положение минимума ППР, и строить график его зависимости от времени. Этот график принято называть "сенсограммой". Всем этим автоматически руководит микропроцессор.
Как видим из рис. 23.8, максимальная концентрация иммобилизованного (т.е. присоединенного к лиганду) аналита достигается лишь через несколько минут. Кинетика нарастания сдвига минимума ППР отображает кинетику химических реакций присоединения аналита к лиганду. Стационарное состояние, которое в конце концов устанавливается, является результатом динамического равновесия между химическими процессами присоединения и диссоциации (отсоединения) аналита и зависит как от констант соответствующих реакций, так и от концентрации аналита, температуры раствора, условий перемешивания и т.п. Это все можно исследовать.
В ходе следующей фазы (ІІІ) инжекция аналита прекращается, но продолжается прокачка чистой жидкости. Процессы присоединения практически прекращаются, идут лишь процессы диссоциации. Ход кривой на этой стадии позволяет вычислить константы этого процесса. А зная их, по результатам измерений в фазе ІІ можно вычислить и константы реакции присоединения. В фазе ІV через ячейку прокачивается раствор элюента, т.е. жидкости, которая, резко ослабляя химическую связь аналита с лигандом, постепенно "вымывает" аналит, практически не влияя на лиганд. И начинается регенерация биочувствительной поверхности, в ходе которой положение минимума ППР должно возвратиться к первоначальному. После этого можно начинать новый цикл измерений химического взаимодействия лиганда с другим или с тем же аналитом, но при других условиях. Практически удается провести свыше 50 разных исследований с одним и тем же лигандом.
Фирма Biacore AB выпускает и узко специализированные ППР сенсоры, как, например, BIACORE Quant, предназначенный специально для определения содержания витаминов.
Значительно более компактный интеллектуальный ППР сенсор SR7000 выпускает фирма Reichert Analytical Instruments, Inc. (
рис.
23.9) [http://www.reichertai.com]. В нем используется расходящийся световой пучок и линейка фотодетекторов, которые обеспечивают наблюдение ППР в пределах углов отражения от 58,5 до 85 
.
